การโคลนยีนโปรตีเอสจาก Bacillus subtilis TISTR25 สู่ Escherichia coli ด้วยระบบหลอมกับจีเอสทียีน

Abstract

เมื่อโคลนโครโมโซมอลดีเอ็นเอจาก Bacillus subtilis TISTR25 ซึ่งเป็นเชื้อที่แยกได้จากดินในประเทศไทย สามารถผลิตทั้งนิวทรัลและแอลคาไลน์โปรตีเอส เข้าสู่ Escherichia coli HB101 โดยอาศัยพาหะดีเอ็นเอ pGEX-2T ของระบบ GST Gene Fusion ทำให้เซลล์เจ้าบ้านสามารถผลิตเอนไซม์โปรตีนเอสที่อยู่ในรูป fusion protein คัดเลือกทรานสฟอร์แมนท์ด้วยการเลี้ยงบนจานอาหาร ที่มีนมผงพร่องไขมัน IPTG และยาแอมพิซิลลิน การศึกษาด้วยวิธีโคโลนีไฮบริไดเซชันกับดีเอ็นเอติดตาม ของยีนนิวทรัลโปรตีนเอสที่ติดฉลากสารกัมมันตภาพรังสี มีสัญญาณการไฮบริไดซ์ของยีนนิวทรัลโปรตีเอส เมื่อเลี้ยงทรานสฟอร์แมนหมายเลข 97 ในอาหารสูตรพื้นฐานที่มีซัคซิเนตเป็นแหล่งต้นตอคาร์บอนเป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่ามีแอคติวิตีจำเพาะสูงสุด 305.08 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน ในภาวะ pH 8.5 และการศึกษาผลของสารยับยั้งต่อความสามารถ ในการทำงานของโปรตีนเอสพบว่าเอนไซม์นี้ถูกยับยั้งการทำงานอย่างสมบูรณ์ในภาวะที่มี EDTA เข้มข้น 5 มิลลิโมลาร์แต่ยังคงมีแอคติวิตีอยู่เมื่ออยู่ในภาวะที่มี PMSF เข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ เป็นการยืนยันว่าทรานสฟอร์แมนผลิตโปรตีเอสชนิดนิวทรัลโปรตีเอส การทำให้ fusion protein บริสุทธิ์ สามารถทำได้ภายใต้ภาวะที่ไม่รุนแรงภายใน คอลัมน์แอฟฟินิตีโครมาโตกราฟีที่มีเจล glutathione Sepharose 4B แล้วแยก fusion protein ด้วยทรอมบิน ทำให้ได้โปรตีเอสอิสระที่มีค่าแอคติวิตีจำเพาะสูงถึง 1,289.18 หน่วยต่อมิลลิกรรัมโปรตีน ที่ pH 8.5 ซึ่งสูงกว่าก่อนทำให้บริสุทธิ์ถึง 4.23 เท่า และเมื่อทำ SDS-PAGE พบว่าโปรตีเอสอิสระมีน้ำหนักประมาณ 44,000 ดาลตัน