Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/17500
| Title: | การแยกและฤทธิ์ของโปรตีนต้านราก่อโรคในมะเขือเทศจาก Bacillus sp. M10 |
| Other Titles: | Isolation and actvity of antifungal protein against fungal pathogens of tomato from Bacillus sp. M10 |
| Authors: | ประภาศรี ศรีคง |
| Advisors: | ปาหนัน เริงสำราญ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | [email protected] |
| Subjects: | มะเขือเทศ -- โรคและศัตรูพืช โรคเกิดจากเชื้อราในพืช สารต้านเชื้อรา |
| Issue Date: | 2552 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | งานวิจัยนี้ได้นำแบคทีเรีย เอ็ม10 ซึ่งสามารถสร้างสารต้านราโรคพืชได้ดีมาทดสอบฤทธิ์ในการต้านรา Fusarium sp. และ Colletotrichum capsici ซึ่งก่อให้เกิดโรคผลเน่าและโรคแอนแทรคโนสในมะเขือเทศ ตามลำดับ พบว่าแบคทีเรีย เอ็ม10 มีสมบัติในการยับยั้งราทั้งสองชนิดได้ จากการทำปฏิกิริยากับกรดไฮโดรคลอริก 1 โมลาร์ และ โซเดียมไฮดรอกไซด์ 1 โมลาร์ สามารถสรุปเบื้องต้นได้ว่าสารออกฤทธิ์นี้เป็นสารประเภทโปรตีน และเป็นโปรตีนที่หลั่งออกนอกเซลล์แบคทีเรีย เมื่อติดตามแอกทิวิตีในการยับยั้งราในระหว่างการเจริญของแบคทีเรียพบว่า การสร้างโปรตีนที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งรานี้มีลักษณะเป็นเมแทบอไลต์ทุติยภูมิ และหลั่งออกมาในระยะ late stationary phase สำหรับการทำบริสุทธิ์โปรตีนประกอบรวมด้วยการตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ 40-60 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นทำคอลัมน์โครมาโทกราฟีแบบอาศัยความแตกต่างของประจุสุทธิของสารบนดีอีเออีเจลอะกาโรส และพบว่าโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งรามีประจุลบและถูกชะออกมาในระหว่างการชะด้วยโซเดียมคลอไรด์ ตั้งแต่ 0-1 โมลาร์ จากการวิเคราะห์ความบริสุทธิ์และหาน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนโดย SDS-PAGE พบโปรตีนเด่นชัดเพียงแถบเดียวและมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 55.35 kDa โปรตีนที่ทำบริสุทธิ์ได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นเป็น 11.10 เท่า มีแอกทิวิตีจำเพาะ 189.57 AU/มิลลิกรัมของโปรตีน จากการทดสอบฤทธิ์ของโปรตีนบนผลมะเขือเทศสายพันธุ์สีดา ท้อ และราชินี พบว่าสามารถป้องกันและยับยั้งการเกิดโรค ในมะเขือเทศทุกสายพันธุ์ได้ดี นอกจากนี้ยังสามารถลดขนาดของแผลบนผลมะเขือเทศได้อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(P<0.05) จากการหาค่า IC[subscript 50] ของโปรตีนต่อการยับยั้งการงอกของสปอร์รา C. capsici และ Fusarium sp. พบว่ามีค่าเท่ากับ 53.05 และ 201.9 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลำดับ ผลการตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและแบบส่องกราดพบว่าโปรตีนที่ทำบริสุทธิ์ได้ทำให้เส้นใยและสปอร์ของราเกิดการบวมและแตกหัก จากการศึกษาลักษณะสมบัติของโปรตีนโดย MALDI-TOF MS พบว่ารูปแบบของเพปไทด์มีความใกล้เคียงกับโปรตีน KatA ของ Bacillus amyloliquefaciens ซึ่งมีแอกทิวิตีของแคทาเลส เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ16S rDNA ของแบคทีเรีย เอ็ม10 พบว่ามีความใกล้เคียงกับ Bacillus sp. เท่ากับ 96% จากผลการทดลองเหล่านี้ทำให้สามารถนำโปรตีนจาก Bacillus sp. เอ็ม10 ไปประยุกต์ใช้เพื่อป้องกันและยับยั้งราดังกล่าวในมะเขือเทศได้ต่อไป |
| Other Abstract: | Bacteria M10 which was able to inhibit the growth of several fungal pathogens was tested against Fusarium sp. and Colletotrichum capsici, the causing agent of fruit rot and antracnose disease in tomato. It was found that bacteria M10 inhibited the growth of both fungi. Preliminary treatment of cultured medium with 1 M HCl and 1 M NaOH indicated that the active substance which was produced and secreted into the medium was protein. Testing the inhibitory activity along with the growth of bacteria, the result showed that this protein was a secondary metabolite and secreted during the late exponential phase. The purification procedure for this protein comprised 40-60% ammonium sulfate precipitation and DEAE anion exchange column chromatography. The antifungal protein had net cationic charge and was eluted during the gradient of 0-1 M sodium chloride. SDS PAGE analysis of the purified protein revealed one single band with a molecular mass of 55.35 kDa. The purity of the protein was increased to 11.10 folds and a specific activity was 189.57 AU/mg of protein. The purified protein demonstrated a great protection and inhibition on three varieties of tomato fruits; Sida, Big, and Queen as observed by smaller lesion size of tomato fruits (P<0.05). The IC[subscript 50] of the purified protein toward Fusarium sp. and C. capsici were 53.05 and 201.9 ug/ml, respectively. Microscopic and scanning electron microscopy observations revealed conidial swelling and rupture of the fungal treated with such protein. Based on MALDI-TOF MS analysis, it was found that the purified protein had peptide fingerprint closest to KatA of Bacillus amyloliquefaciens which contains catalase activity. Bacterial identification using 16S rDNA sequencing revealed that the bacteria had 96% identity to Bacillus sp. This antifungal protein from Bacillus sp. M10 could possibly be used as a biocontrol protein to protect tomato fruits from fungal diseases |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2552 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/17500 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2009.1244 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2009.1244 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Prapasri_Sri.pdf | 3.05 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.