สารออกฤทธิ์จาก Bacillus subtilis N3 และ Pseudomonas aeruginosa RS1 ในการยับยั้งราก่อโรคในกล้วยไม้

Abstract

งานวิจัยนี้มีเป้าหมายเพื่อหาแบคทีเรียและผลิตภัณฑ์โปรตีนจากแบคทีเรียที่สามารถยับยั้งการเจริญของ Curvularia lunata และ Phytophthora palmivora ซึ่งเป็นราและราน้ำที่ก่อให้เกิดโรคในกล้วยไม้ ตามลำดับ งานวิจัยส่วนแรกศึกษาโดยใช้ Pseudomonas aeruginosa RS1 ซึ่งมีความสามารถในการยับยั้งการเจริญของ P. palmivora ซึ่งเป็นราน้ำที่ก่อให้เกิดโรคเน่าดำหรือโรคเน่าเข้าไส้ในกล้วยไม้ ผลการหาภาวะที่เหมาะสมสำหรับการเลี้ยงแบคทีเรียเพื่อให้สร้างสารออกฤทธิ์ยับยั้ง P. palmivora พบว่า ให้ประสิทธิภาพดีที่สุดเมื่อเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว LB pH7 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 21 ชั่วโมง การตกตะกอนโปรตีนจากน้ำเลี้ยงเชื้อส่วนใสด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นในช่วง 40-80% แล้วนำไปทำบริสุทธิ์โปรตีนด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีบน DEAE Bio-gel A พบว่า โปรตีนในช่วงลำดับส่วนที่ 9-10 และ 33-34 มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเจริญของ P. palmivora เท่ากับ 75.00% และ 82.35% ตามลำดับ โดยเมื่อนำไปวิเคราะห์ต่อด้วยวิธี SDS-PAGE และวิเคราะห์ด้วย Q exactive plus hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometry ที่ต่อกับ liquid chromatography พบว่าช่วงลำดับส่วนที่ 9-10 มีมวลโมเลกุลของโปรตีนหลายขนาด ได้แก่ 54 kDa, 32 kDa และ 20 kDa โดยโปรตีนเหล่านี้มีความคล้ายคลึงกับคะตะเลส, โปรตีเอส และโปรตีเอส IV ตามลำดับ โปรตีนที่อยู่ในช่วงลำดับส่วนที่ 33-34 มีมวลโมเลกุลของโปรตีนเท่ากับ 40 kDa, 32 kDa และ 29 kDa และมีความคล้ายคลึงกับโปรตีนซึ่งยึดเกาะไคติน, โปรตีเอส และโปรตีเอส ตามลำดับ เมื่อศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พบว่าโปรตีนบริสุทธิ์ส่งผลให้เส้นใยของ P. palmivora มีการเจริญผิดปกติ งานวิจัยอีกส่วนหนึ่งศึกษาโดยใช้ B. subtilis N3 ที่มีฤทธิ์ต้านการเจริญของ C. lunata ซึ่งเป็นราที่ก่อให้เกิดโรคดอกสนิมในกล้วยไม้ เมื่อเลี้ยงแบคทีเรียในภาวะที่ผลิตสารต้านราได้ดีที่สุด แล้วนำส่วนใสมาตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ช่วงความเข้มข้น 40-80% แล้วทำบริสุทธิ์โปรตีนด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีบน DEAE Bio-gel A พบว่า โปรตีนในช่วงลำดับส่วนที่ 51-60 มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของ C. lunata ได้ดีที่สุด เมื่อนำโปรตีนไปวิเคราะห์ด้วยด้วยวิธี SDS-PAGE และ ESI-Q-TOF MS/MS พบว่าโปรตีนกึ่งบริสุทธิ์มีมวลโมเลกุลเท่ากับ 39.88 kDa โปรตีนกึ่งบริสุทธิ์นี้มีความคล้ายคลึงกับโปรตีนคล้ายแฟลกเจลลินของ Bacillus subtilis สูงถึง 69% ของบริเวณที่ครอบคลุมลำดับของโปรตีน จากการศึกษาลำดับกรดอะมิโนที่คาดหมายจากลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนแฟลกเจลลินของ B. subtilis N3 พบว่ามีความใกล้เคียงกับลำดับกรดอะมิโนของแฟลกเจลลินของ B. subtilis มากถึง100% เมื่อทดสอบความสามารถของ B. subtilis N3 ในการต้านการเจริญของราที่ก่อโรคในพืชบนอาหารเลี้ยงเชื้อ พบว่า B. subtilis N3 มีความสามารถในการยับยั้งราได้หลายชนิด เมื่อทดสอบความสามารถของน้ำเลี้ยงเชื้อส่วนใสจาก B. subtilis N3 กับต้นกล้วยไม้สกุลช้างกระและสกุลหวาย พบว่าน้ำเลี้ยงเชื้อส่วนใสจาก B. subtilis N3 สามารถป้องกันและรักษากล้วยไม้จากการเกิดโรคโดย P. palmivora ได้ดี แบคทีเรียและ/หรือโปรตีนที่ได้จากงานวิจัยนี้ มีสมบัติที่น่าจะสามารถนำไปพัฒนาเชิงพาณิชย์เพื่อใช้ในการเกษตรแบบยั่งยืนได้ต่อไป