Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59265
| Title: | การพัฒนาวิธีการตรวจสอบ Vibrio parahaemolyticus ในอาหารทะเลสดโดยอาศัยสมบัติการสร้างสารเอซิลโฮโมซีรีนแลกโทน |
| Other Titles: | Development of method for Vibrio parahaemolyticus detection in fresh seafood based on acyl homoserine lactone production property |
| Authors: | กิติมา เชื้อพานิช |
| Advisors: | ชื่นจิต ประกิตชัยวัฒนา พัชณิตา ธรรมยงค์กิจ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | [email protected] [email protected] |
| Subjects: | Vibrio parahaemolyticus |
| Issue Date: | 2552 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบ Vibrio parahaemolyticus เชิงปริมาณในอาหารทะเลสด โดยอาศัยสมบัติการสร้างสัญญาณควอรัมเซนซิงชนิดเอซิลโฮโมซีรีนแลกโทน (AHL) การทดลองเริ่มจากการประเมินสารที่ใช้ในการทำปฏิกิริยากับสารมาตรฐาน AHL สำหรับพัฒนาเป็นวิธีทาง colorimetry ผลการทดลองพบว่า การใช้ Ferric chloride (FeCl3) ทำปฏิกิริยากับ AHL ให้สารประกอบสีที่เด่นชัดและเสถียรที่สุด จึงเลือกใช้เป็นวิธีทาง colorimetry สำหรับใช้ในการตรวจสอบ AHL ที่สร้างจาก V. parahaemolyticus เมื่อตรวจยืนยันการสร้าง AHL โดยการวิเคราะห์สารชะจากโคโลนี (colony rinse) ของ V. parahaemolyticus ด้วย HPLC ผลการทดลองบ่งชี้ว่าแบคทีเรียชนิดนี้สร้างสาร AHL ชนิด 3-hydroxyl-C4-HSL เป็นหลัก เมื่อประเมินวิธีการตรวจสอบ AHL ที่สร้างจาก V. parahaemolyticus ด้วยวิธี colorimetry ที่พัฒนาได้ โดยการตรวจวัดสมบัติการดูดกลืนแสงของสารประกอบสีที่เกิดขึ้น พบว่ามีค่า λmax ประมาณ 520 นาโนเมตร จากผลการทดลองยืนยันได้ว่าสารประกอบสีที่เกิดขึ้นในคัลเจอร์ของ V. parahaemolyticus เกิดจากการทำปฏิกิริยาเคมีที่จำเพาะระหว่าง FeCl3 กับ AHL ที่เชื้อสร้างขึ้นเท่านั้น ดังนั้นจึงใช้วิธี colorimetry ในการตรวจสอบ AHL ที่สร้างจาก V. parahaemolyticus ในการทดลองต่อไป เมื่อประเมินความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการเจริญกับการสร้าง AHL ของ V. parahaemolyticus ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่มีเกลือ พบว่าปริมาณ AHL ที่ตรวจวัดได้แปรผันตามจำนวนเซลล์ โดยในทุกความเข้มข้นเกลือ เมื่อเชื้อเจริญถึงจำนวนเซลล์ประมาณ 9logCFU/ml ค่า AHL ที่ตรวจวัดได้จะมีค่าเท่ากับ 0.1 (OD520) เสมอ ดังนั้นจึงเลือกใช้ peptone water (ร้อยละ 1) ที่มีเกลือร้อยละ 8 เป็นระบบ selective pre-enrichment media สำหรับใช้ในการเลี้ยงเชื้อภายใต้สภาวะอุณหภูมิห้อง และให้อากาศแบบ orbital shaking ที่ 200 rpm เพื่อให้เชื้อเริ่มต้นเพิ่มจำนวนมากขึ้นจนสร้าง AHL ถึงระดับที่ตรวจวัดได้ (OD520 ≥ 0.1) โดยเวลาที่ใช้ในการเจริญจนสร้าง AHL ถึงระดับที่ตรวจวัดได้ดังกล่าว เรียกว่า detection time (DT) ซึ่งพบว่า ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงในระบบ selective pre-enrichment media นี้ เมื่อมีจำนวนเซลล์เริ่มต้น 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107 และ 108 CFU/ml จะมีค่า DT เท่ากับ 26, 24, 22, 20, 16, 14, 12 และ 10 ชั่วโมง ตามลำดับ โดยที่จำนวนเซลล์เริ่มต้นและค่า DT มีความสัมพันธ์กันแบบเส้นตรง (y = –0.386x+11.82) และมีค่า r² เท่ากับ 0.99 เมื่อตรวจสอบปัจจัยต่างๆที่อาจมีอิทธิพลต่ออัตราการเจริญและการสร้าง AHL ของ V. parahaemolyticus ได้แก่ การมีอันตรกิริยากับจุลินทรีย์ชนิดอื่น การสัมผัสกับอุณหภูมิแช่เย็นหรือแช่เยือกแข็งก่อนการเพาะเลี้ยง และอิทธิพลจากองค์ประกอบของอาหารทะเล พบว่า ทุกปัจจัยมีอิทธิพลต่อสมบัติการเจริญและการสร้าง AHL ของ V. parahaemolyticus อย่างมีนัยสำคัญ แต่ยังสามารถใช้สมการเส้นตรงเดิมในการทำนายจำนวนเซลล์เริ่มต้นได้ ยกเว้นการที่เชื้อสัมผัสกับอุณหภูมิแช่เยือกแข็ง มีผลให้เชื้อมีการเจริญช้าลง ทำให้ค่า DT ยาวขึ้น 2 ชั่วโมง เมื่อนำระบบที่พัฒนาได้ไปทดลองใช้ในการประมาณจำนวนเซลล์ V. parahaemolyticus ในตัวอย่างอาหารทะเล ด้วยการติดตามค่า DT เปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน MPN ก็พบว่าผลการตรวจสอบที่ได้มีความสอดคล้องกัน แสดงให้เห็นว่าวิธีที่พัฒนาได้มีศักยภาพที่จะใช้ในการตรวจสอบการปนเปื้อน V. parahaemolyticus ในอาหารทะเลต่อไปได้ |
| Other Abstract: | This study aimed to develop the methods for quantitative determination of V. parahaemolyticus based on its quorum sensing; acyl homoserine lactone (AHL) production property. Initially, the chemical reactions for AHL standard detection was evaluated to be developed as the colorimetric method. It was found that the coloring complex from AHL and FeCl3 reaction was more obvious and stable, compared with the reaction using NH4Fe(SO4)2 reagent. This reaction was then used as the detection method for AHL produced from V. parahaemolyticus. The AHL production of V. parahaemolyticus was confirmed by HPLC analysis. The results indicated that V. parahaemolyticus could produce mainly 3-hydroxyl-C4-HSL. Subsequently, the colorimetric method for the detection of AHL from V. parahaemolyticus was evaluated by determining the absorption property of the coloring complex. It was found that the coloring complex had maximum absorption (λmax) at 520 nm. In addition, the results also indicated that the coloring complex in the culture of V. parahaemolyticus was generated from the specific reaction between FeCl3 and AHL. The medium composition and metabolites secreted from V. parahaemolyticus did not interfere the colorimetric detection. The colorimetry was then used to investigate AHL production property of V. parahaemolyticus cultured under salt conditions. It was found that the AHL production of V. parahaemolyticus cultivated under these conditions depended upon cell density and it was detectable at 0.1 (OD520) when cell density reached approximately 9logCFU/ml. Therefore, 1%peptone water containing 8%NaCl was used as selective pre-enrichment media for V. parahaemolticus to produce AHL by cultivation at 200 rpm orbital shaking at room temperature. The cell number of V. parahaemolyticus could be estimated from the detection time (DT) when initial cell reached 9.1logCFU/ml. In pure culture system, the DT was 26, 24, 22, 20, 16, 14, 12 and 10 hours for the initial cell population at 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107 and 108 CFU/ml, respectively (y = –0.386x+11.82). The factors that might influence the growth and AHL production of V. parahaemolticus including bacterial interaction, exposure of cells to chilling and freezing temperature prior to determination and food matrix were investigated. It was found that all factors significantly influenced the growth and AHL production but the same DT equation could still be used to estimate cell population. In exception, the pre-exposure of cell to freezing temperature resulted in slow growth in the selective pre-enrichment condition, leading to a delay in DT for two hours. Finally, the developed method was then used for quantitative determination of V. parahaemolyticus in seafood sample comparing with MPN method. The results from both methods were correlated. It indicated that this methodology can be potentially used for V. parahaemolyticus detection in fresh seafood. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2552 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | เทคโนโลยีทางอาหาร |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59265 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2009.2159 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2009.2159 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Kitima Chueapanich.pdf | 1.45 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.