การสังเคราะห์พีเอ็นเอแอเรย์บนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิว เพื่อใช้ตรวจสอบลำดับเบสของสารพันธุกรรม

Abstract

กระดาษกรองเป็นวัสดุที่เหมาะแก่การนำมาใช้เป็นวัฏภาคของแข็งสำหรับการตรึงสารชีวโมเลกุลเพื่อใช้ เป็นตัวตรวจวัดเชิงชีวภาพ เนื่องจากกระดาษกรองเป็นวัสดุที่หาได้ง่าย, สามารถเข้ากันได้กับระบบชีวภาพ และ สามารถดัดแปรพื้นผิวเป็นหมู่ฟังก์ชันต่างๆ ได้หลากหลาย ในงานวิจัยนี้ นำพิโรลิดินิลพีเอ็นเอ ซึ่งมีโครงสร้างหลัก เป็น D-prolyl-2-aminocyclopentanecarboxylic acid (เอซีพีซีพีเอ็นเอ, ในงานนี้จะเรียกเป็นพีเอ็นเอ) ตรึง บนพื้นผิวเซลลูโลสเพื่อใช้เป็นโพรบในการตรวจสอบลำดับเบสของดีเอ็นเอ ขั้นแรกเป็นสังเคราะห์ไดแอลดีไฮด์ เซลลูโลส หรือ ดีเอซี โดยการดัดแปรพื้นผิวกระดาษกรองโดยปฏิกิริยาออกซิเดชันบางส่วนด้วยโซเดียมเปอร์ ไอโอเดตผสมลิเทียมคลอไรด์ และพิสูจน์เอกลักษณ์หมู่แอลดีไฮด์ที่เกิดขึ้นโดยใช้การทดสอบที่ทำให้เกิดสีโดย 2,4-dinitrophenylhydrazine จากนั้นเป็นการตรึงพีเอ็นเอโพรบลงบนกระดาษกรองที่ผ่านดัดแปรพื้นผิวด้วย ปฏิกิริยารีดักทีฟแอลคิลเลชันโดยมีโซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์อยู่ด้วย การทดสอบโดยใช้พีเอ็นเอติดฉลาก ฟลูออเรสซีนยืนยันว่าสามารถตรึงพีเอ็นเอบนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิวได้จริง ลำดับถัดมาเป็นการตรวจสอบ ความสามารถในการจับยึดระหว่างพีเอ็นเอที่ถูกตรึงกับดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันโดยใช้พีเอ็นเอไม่ติดฉลากกับ ดีเอ็นเอติดฉลากฟลูออเรสซีน พบว่าสามารถตรวจวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนส์ภายใต้แสงยูวีได้ที่ปริมาณดีเอ็นเอ ตัวอย่างเพียง 0.35 pmol แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของวิธีการตรึงพีเอ็นเอบนกระดาษดัดแปรพื้นผิวเป็นหมู่ แอลดีไฮด์นี้ในการสร้างเป็นพีเอ็นเอแอเรย์ นอกจากนี้ ในงานวิจัยยังได้พัฒนาวิธีการตรวจสอบความสามารถใน การจับยึดระหว่างพีเอ็นเอที่ถูกตรึงกับดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันโดยอาศัยปฏิกิริยาสร้างสีที่สามารถมองเห็นได้ด้วย ตาเปล่าโดยอาศัยเอนไซม์ เพื่อเพิ่มความไวในการตรวจวัดและเลี่ยงการใช้วิธีติดฉลากฟลูออเรสซีนที่มีราคาแพง บนสายดีเอ็นเอเป้าหมาย โดยเมื่อเกิดการจับยึดระหว่างพีเอ็นเอโพรบกับดีเอ็นเอติดฉลากไบโอติน แล้วเติม เอนไซม์ horseradish peroxidase ที่เชื่อมต่อกับสเตรปตาวิดิน ตามด้วย o-phenylenediamine/H2O2 จะได้ ผลิตภัณฑ์สีเหลืองซึ่งสามารถสังเกตเห็นได้ด้วยตาเปล่า โดยดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ที่ประกอบด้วยพีเอ็นเอโพรบที่ตรึง บนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิวเมื่อใช้ร่วมกับวิธีการตรวจวัดด้วยปฏิกิริยาสร้างสีที่สามารถมองเห็นได้ด้วย ตาเปล่าโดยอาศัยเอนไซม์มีขีดจำกัดต่ำพอที่จะตรวจวัดดีเอ็นเอที่มีปริมาณต่ำกว่าระดับ picomole ได้ ทั้งยังมี ความจำเพาะเจาะจงที่ดีโดยสามารถแยกความแตกต่างของดีเอ็นเอที่ติดฉลากไบโอติน 2 สายที่มีลำดับเบส ต่างกันเพียง 1 ตำแหน่งได้อย่างชัดเจน