Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69384
| Title: | การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION เพื่อตรวจหาเชื้อ Mycobacterium avium COMPLEX ด้วยตาเปล่า |
| Other Titles: | Development of recombinase polymerase amplification for naked eye detection of Mycobacterium avium Complex |
| Authors: | เทิดศักดิ์ สุธาตุ |
| Advisors: | ปาหนัน รัฐวงศ์จิรกุล |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์ |
| Advisor's Email: | [email protected] |
| Subjects: | มัยโคแบคทีเรียมเอเวียม การวินิจฉัยโรคระดับโมเลกุล Mycobacterium avium Molecular diagnosis |
| Issue Date: | 2562 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | โรคติดเชื้อที่มีสาเหตุมาจาก Mycobacterium avium complex (MAC) มีอุบัติการณ์เพิ่มสูงขึ้นทั่วโลกรวมทั้งในประเทศไทย เนื่องมาจากการเพิ่มขึ้นของจำนวนผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันของร่ายกายต่ำ การวินิจฉัยเชื้อ MAC ในปัจจุบันที่อาศัยการเพาะเลี้ยงเชื้อและทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมี นอกจากใช้ระยะเวลานานแล้ว ยังไม่สามารถจำแนกเชื้อได้ถึงระดับสปีชี่ส์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเชื้อ Mycobacterium avium และเชื้อ Mycobacterium intracellulare ซึ่งเป็นเชื้อ MAC ที่สำคัญและเพาะแยกได้บ่อยจากสิ่งส่งตรวจ ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ คือการพัฒนาเทคนิค Recombinase Polymerase Amplification ร่วมกับการอ่านผลด้วยสี SYBR Green I (RPA/SYBR) ในการตรวจวินิจฉัยเชื้อ MAC ซึ่งอาศัยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมภายใต้อุณหภูมิคงที่ ร่วมกับไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อกลุ่ม MAC เชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare และอ่านผลที่เกิดขึ้นด้วยตาเปล่าได้ในทันทีภายหลังการเติมสี SYBR Green I ผลจากการทดสอบกับตัวอย่าง DNA ของเชื้อ MAC จำนวน 120 ตัวอย่าง พบว่าเทคนิค RPA/SYBR สามารถตรวจวินิจฉัยจำแนกสปีชี่ส์ของเชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยมีความไว 100% และความจำเพาะตั้งแต่ 80.7% ขึ้นไป ซึ่งจัดว่ามีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีหาลำดับเบส (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.801 ขึ้นไป) ในขณะที่เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค PCR มีความไวตั้งแต่ 89.2% ขึ้นไปและความจำเพาะตั้งแต่ 97.5% ขึ้นไป และมีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเช่นเดียวกัน (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.863 ขึ้นไป) นอกจากนี้เทคนิค RPA/SYBR ยังมีค่าความเข้มข้นของ DNA ต้นแบบน้อยที่สุดที่สามารถตรวจได้ เท่ากับ 1 ng/µl และไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับเชื้อส่วนใหญ่ของ Mycobacterium แม้ว่าเทคนิค RPA/SYBR ที่ได้พัฒนาขึ้น มีขั้นตอนการทดสอบที่ทำง่าย ไม่ซับซ้อน ให้ผลการทดสอบที่รวดเร็ว และสามารถอ่านผลได้ด้วยตาเปล่า และไม่จำเป็นต้องอาศัยเครื่องมือที่จำเพาะ ซึ่งเหมาะสำหรับนำมาใช้ตรวจคัดกรองเบื้องต้นในการวินิจฉัยเชื้อ MAC ในห้องปฏิบัติการในโรงพยาบาลขนาดเล็ก หรือห้องปฏิบัติการภาคสนาม อย่างไรก็ตาม ควรมีการศึกษาพัฒนาความจำเพาะเพิ่มเติม เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของเทคนิคดังกล่าวในอนาคต |
| Other Abstract: | Infections caused by Mycobacterium avium complex (MAC) has been increased globally, including Thailand, owing to the rising in immunocompromised patients. A current diagnosis, based on culture and biochemical tests, is time-consuming. Furthermore, it is not enabled to differentiate MAC in a species level, particularly between the most common isolated MAC, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. Thus, this study aimed to develop Recombinase Polymerase Amplification combined with a SYBR Green I, called RPA/SYBR, for diagnosis of MAC. The RPA/SYBR was depended on isothermal amplification directed by specific primers to MAC, M. avium and M. intracellulare, and was immediately read out by a naked eye after addition of a SYBR Green I. After examined with 120 DNA samples of MAC, RPA/SYBR was capable of differentiating between M. avium and M. intracellulare effectively. RPA/SYBR shown 100% and over 80.7% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.801) when compared with nucleotide sequencing. While analyzing with PCR, RPA/SYBR shown over 89.2% and over 97.5% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.863). Besides, a limit of detection of RPA/SYBR was 1 ng/µl, and there were no cross-reactions with most of the Mycobacterium species. Although, the developed RPA/SYBR was simple, rapid, easy for read out by a naked eye without the specific instruments, which is proper for a screening diagnosis of MAC in small healthcare settings or field laboratories. However, further development to improve a specificity should be concerned, in order to raise the efficiency of RPA/SYBR in future. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2562 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69384 |
| URI: | http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2019.1151 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.58837/CHULA.THE.2019.1151 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | All - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 5976660037.pdf | 6.12 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.