ผลของสภาวะการเลี้ยงโอโอไซต์ต่อการปฏิสนธินอกร่างกายของลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ : รายงานผลการวิจัย

Abstract

วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้ เพื่อศึกษาศักยภาพของรังไข่ลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ด้านการตอบสนองต่อการกระตุ้นการเจริญของฟอลลิเคิลหลายใบด้วยฮอร์โมนโกนาโดโทรปินจากภายนอก และศึกษาความเหมาะสมของสภาพการเพาะเลี้ยงโอโอไซต์ของลูกโคภายนอกร่างกาย รวมถึงศึกษาความเหมาะสมของระบบเพาะเลี้ยงตัวอ่อนที่ได้จากการปฏิสนธินอกร่างกายของโอโอไซต์ของลูกโคจนถึงระยะพร้อมนำไปย้ายฝาก โดยทำการทดลองในลูกโค 3 ชุด คือ ลูกโคนมพันธุ์โฮสไตน์ ฟรีเชี่ยนจำนวน 9 ตัว ลูกโคนมพันธุ์ผสม จำนวน 9 ตัว และลูกโคไทยพื้นเมืองจำนวน 8 ตัว อายุระหว่าง 6-12 เดือน โปรแกรมการกระตุ้นรังไข่มี 2 โปรแกรม โปรแกรมแรกใช้กับลูกโคชุดที่หนึ่งและสอง ทำการฝังฮอร์โมนโปรเจสเตอโรนที่ใต้ผิวหนังหลังใบหูนาน 7 วันก่อนเริ่มให้ฮอร์โมนชนิด ฟอลลิเคิล สติมูเลติ่ง ฮอร์โมนขนาด 120-180 มิลลิกรัมต่อตัว ร่วมกับโกนาโดโทรปิน รีลิสซิ่ง ฮอร์โมนในขนาด 100 ไมโครกรัมต่อตัว โปรแกรมที่สองใช้กับลูกโคชุดที่สาม ใช้ฮอร์โมนชนิดฟอลลิเคิล สติมูเลทิ่ง ฮอร์โมน ในขนาด 120 มิลลิกรัมต่อตัวเพียงอย่างเดียว เปิดผ่าช่องท้องลูกโคเพื่อดึงรังไข่ขึ้นมานับจำนวนฟอลลิเคิลภายหลังเสร็จสิ้นการให้ฮอร์โมนแล้ว 24 ชั่วโมง พบว่าจำนวนฟอลลิเคิลบนรังไข่มีการแปรปรวนไปในระหว่างลูกโคแต่ละตัว (8-121 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดแรก, 13-99 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดที่สอง และ 23-75 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดที่สาม) เส้นผ่านศูนย์กลางของฟอลลิเคิลที่พบบนรังไข่ลูกโคชุดที่หนึ่ง สอง และ สาม เท่ากับ 0.51+-0.24,0.64+-0.28 และ 0.54+-0.20 เซนติเมตร ตามลำดับ พบว่าฟอลลิเคิลบนรังไข่ของลูกโคชุดที่สองมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยมากกว่าลูกโคชุดแรกและชุดที่สองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ อัตราการเก็บโอโอไซต์ได้จากการเจาะเก็บด้วยวิธีใช้เข็มฉีดยาต่อกับกระบอกฉีดยาเจาะดูดจากฟอลลิเคิลโดยตรงเท่ากับ 24.5% ซึ่งต่ำกว่าการเจาะด้วยการใช้เข็มต่อกับเครื่องดูดสุญญากาศที่แรงดูด 120 มิลลิเมตรปรอทที่เก็บได้ 59.6% และการตัดรังไข่ออกทั้งสองข้างแล้วนำไปเจาะดูดโอโอไซต์ในห้องปฏิบัติการที่เก็บได้ 56.3% อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ชนิดของโอโอไซต์ที่เจาะเก็บได้โดยรวม เป็นโอโอไซต์ที่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มหนาแน่น 33.4% มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มเพียงชั้นเดียวหรือบางส่วน 31.8% เซลล์คิวมูลัสแผ่กระจาย 30.5% ไม่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้ม 2.3% และเป็นโอโอไซต์ที่เสื่อมสลาย 2.0% วิธีการเจาะเก็บโอโอไซต์มีผลต่อชนิดของโอโอไซต์ที่ได้ การใช้เข็มฉีดยาเจาะดูดโอโอไซต์จากฟอลลิเคิลโดยตรงจะได้โอโอไซต์ชนิดที่มีเซลล์คิวมูลัสแผ่กระจายมากที่สุด (41.8%) เช่นเดียวกับการเจาะเก็บโอโอไซต์จากรังไข่ที่ถูกตัดออกจากตัวสัตว์แล้ว (36.7%) การใช้เครื่องดูดสุญญากาศที่แรงดูด 120 มิลลิเมตรปรอท จะได้โอโอไซต์ชนิดที่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มหนาแน่นมากที่สุด (42.5%) โอโอไซต์ที่มีเซลล์คิวมูลัสแผ่กระจาย 29.4% มีโครโมโซมในระยะพร้อมปฏิสนธิทันทีที่เจาะเก็บได้ และมีอัตราการเสื่อมสลายของโครโมโซมเพิ่มขึ้นเมื่อทำการเพาะเลี้ยงนานเกินกว่า 2 ชั่วโมง ส่วนโอโอไซต์ที่ยังไม่พร้อมปฏิสนธิมีอัตราการพัฒนาสู่ระยะพร้อมปฏิสนธิสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงนาน 28 ชั่วโมง (24.2%) เมื่อเปรียบเทียบการพัฒนาระหว่างโอโอไซต์จากลูกโคกับโคโตเต็มวัยพบว่า โอโอไซต์จากโคโตเต็มวัยมีการพัฒนาเร็วกว่าโอโอไซต์ที่ได้จากลูกโคในชั่วโมงที่ 8 และ 16 ของการเพาะเลี้ยง เมื่อนำมาปฏิสนธินอกร่างกายพบว่าโอโอไซต์สามารถเกิดการปฏิสนธิและแบ่งตัวได้โดยทดลองเลี้ยงในน้ำยาเพาะเลี้ยงชนิด TCM 199 ที่เติมซีรั่ม 20% และน้ำยาเพาะเลี้ยงชนิด B2 ที่เลี้ยงร่วมกับเซลล์ VERO (37.4%กับ 34.6%) แต่ไม่มีตัวอ่อนพัฒนาถึงระยะมอรูล่าหรือบลาสโตซิส จากการทดลองแสดงให้เห็นว่าสามารถกระตุ้นรังไข่ของลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ และเลี้ยงให้พร้อมปฏิสนธิได้ แต่อัตราการปฏิสนธิได้ แต่อัตราการปฏิสนธิค่อนข้างต่ำและตัวอ่อนไม่สามารถพัฒนาได้ถึงระยะที่เหมาะสมในการย้ายฝากในโคตัวรับ