การตรวจวินิจฉัยแยกชนิดเชื้อบิดในไก่ด้วยวิธี PCR-RFLP

Abstract

โรคบิดในไก่เป็นโรคโปรโตซัวมีสาเหตุมาจากเชื้อบิดในสกุล Eimeria โดยทั่วไปพื้นฐานของการตรวจแยกชนิดเชื้อบิดในไก่เป็นการแยกจากลักษณะรูปร่างของเชื้อบิดและบริเวณตำแหน่งในลำไส้ของไก่ที่ติดเชื้อบิด ซึ่งจากหลักการนี้พบว่าการตรวจแยกความแตกต่างชนิดของเชื้อบิดในบางครั้งให้ผลไม่น่าเชื่อถือ จึงได้มีการพัฒนานำวิธี Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR-RFLP) มาใช้เพื่อแยกชนิดเชื้อบิด โดยเพิ่มปริมาณ DNA ตรงบริเวณ 18S ribosomal RNA gene (18S rRNA gene) ได้ผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 422 bp และนำผลิตภัณฑ์ PCR มาแยกชนิดเชื้อบิดด้วยเอ็นไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ Alu I, Hha I, Hpa II และ Hae III โดยความไวของวิธี PCR นั้นอยู่ที่ 0.12 โอโอซีสต์ และความไวของวิธี PCR-RFLP อยู่ที่ 8 โอโอซีสต์ และวิธีนี้ยังมีความจำเพาะต่อเชื้อบิด Eimeria มากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ DNA ที่สกัดจากปรสิตในระบบทางเดินอาหารของไก่และแพะ ได้แก่ Raillietina cesticillus, R. chinobothrida, R. Tetragona, Ascaridia galli, Gongglonema spp., Heterakis gallinae, Tetrameres spp. และ Trichostronglylus spp. จากการศึกษาแยกชนิดเชื้อบิด E. tenella CD38 ประกอบด้วยเชื้อบิด 3 ชนิด คือ E. tenella มีปริมาณสัมพันธ์มากที่สุดคือ 64%, E. necatrix 32% และ E. maxima 4% และเชื้อบิดที่ประกอบอยู่ในวัคซีนเชื้อเป็น Immucox[superscript (R)] (I) มีอย่างน้อย 4 ชนิด คือ E. acervulina มีปริมาณสัมพันธ์มากที่สุดคือ 26%, E. maxima 19%, E. necatrix 3% และ E. tenella 3% โดยการแยกชนิดของเชื้อบิด E. tenella CB38 ที่กระจายอยู่ตามลำไส้ส่วนต่างๆ ได้แก่ ลำไส้ส่วนต้น พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. acervulina ปริมาณสัมพันธ์ 84% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 1 พบเชื้อบิด 4 ชนิด ได้แก่ E. necatrix ปริมาณสัมพันธ์ 26%, E. acervulina 21%, E. tenella 14% และ E. maxima 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 2 พบเชื้อบิด 3 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 69%, E. necatrix 7% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนท้าย พบเชื้อบิดได้ 3 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 73%, E. necatrix 16% และ E. tenella 7% และไส้ตันพบเชื้อบิดได้ 3 ชนิด คือ E. tenella ปริมาณสัมพันธ์ 52%, E. necatrix 43% และ E. maxima 4% ส่วนไก่ที่ติดเชื้อบิดจากวัคซีนเชื้อเป็น Immucox[superscript (R)] (I) สามารถแยกชนิดเชื้อบิดที่บริเวณลำไส้ส่วนต้นได้ 2 ชนิด คือ E. acervulina ปริมาณสัมพันธ์ 73% และ E. maxima 3% ลำไส้ส่วนกลางที่ 1 พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 90% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 2 พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 94% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนท้าย พบเชื้อบิด 2 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 87% และ E. tenella 8% และไส้ตัน พบเชื้อบิด 3 ชนิด คือ E. necatrix ปริมาณสัมพันธ์ 45%, E. tenella 40% และ E. maxima 13% ดังนั้นวิธี PCR-RFLP สามารถใช้แยกความแตกต่างทางพันธุกรรมของเชื้อบิดในไก่ได้ โดยมีความไวและความจำเพาะที่เหมาะสมในการนำมาประยุกต์ใช้ตรวจวินิจฉัยและยังสามารถยืนยันได้ว่าพบเชื้อบิด E. tenella หรือ E. maxima ได้ทุกบริเวณของลำไส้ไก่อีกด้วย