ผลของการติดอิพิโทปที่ปลายด้าน N- ของเอนไซม์คาร์บอนิกแอนไฮเดรสไอโซไซม์ II ของมนุษย์ที่มีต่อแอคทิวิตี้ของมันในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae

Abstract

คาร์บอนิกแอนไฮเดรส (CA) เป็นเอนไซม์ที่ทำหหน้าที่เร่งปฎิกิริยาแบบผันกลับของคาร์บอนไดออกไซด์ (CO₂) กับน้า (H₂O) ให้กลายเป็นไบคาร์บอเนต แอนไอออน (HCO₃-) กับโปรตอน (H+) การแสดงออกของเอนไซม์ออกของเอนไซม์ CA โดยเฉพาะ human CA II (hCAII) มีความสัมพันธ์กับการก่อโรคต่าง ๆ ในมนุษย์ อาทิเช่น โรคต้อหิน เป็นต้น โดย hCAII ทำหน้าที่ในการผลิต HCO₃- ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของน้ำหล่อเลี้ยงลูกตา (aqueous humor) ในผู้ป่วยโรคต้อหินการระบายน้ำหล่อเลี้ยงตามีความบกพร่องทำให้ความดันภายในลูกตามีระดับที่สูงขึ้นและอาจนำไปสู่การสูญเสียการมองเห็น ดังนั้นการลดการผลิตน้ำหล่อเลี้ยงลูกตาจึงเป็นจุดมุ่งหมายของการรักษาโรค อย่างไรก็ตามในการค้นหายารักษาโรคต้อหินจำเป็นที่จะต้องมีระบบที่มีประสิทธิภาพในการค้นหา โครงงานนี้เป็นส่วนหนึ่งในโครงการวิจัยพัฒนาระบบคัดกรองฐานยีสต์สำหรับการค้นหาสารออกฤทธิ์ยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ hCAII หรือไม่ โดยมีจุดประสงค์เพื่อที่จะศึกษาว่าการติดอิพิโทป His ที่ตำแหน่งปลายด้าน N- ส่งผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์ hCAII ชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดประมาณ 800 คู่เบส ถูกเพิ่มจำนวนขึ้นโดยปฎิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสด้วยคู่ไพรเมอร์จำเพาะ โดยมีพลาสมิด pRS414 (GAL1.4_hCAII) เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ จากนั้นชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกไลเกชั่นกับพลาสมิดที่ใช้แสดงออกในยีสต์ (Yeast expression plasmid) เพื่อให้ได้รับพลาสมิด N-His-hCAII ที่แสดงออกภายใต้การควบคุมของ GAL1 โปรโมเตอร์ ซึ่งเป็นโปรโมเตอร์ชนิดที่ถูกชักนำให้มีการแสดงออกได้ พลาสมิดที่ได้ถูกนำไปทรานสฟอร์มเข้าสู่เซลล์ยีสต์ Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ที่ขาดยีน NCE103 (Δnce103) หรือยีนที่ประมวลรหัสเอนไซม์คาร์บอนิกแอนไฮเดรสในยีสต์ ผลการทดลองพบว่า hCAII ที่ถูกติดด้วยอิพิโทป His ที่ปลายด้าน N- สามารถทำหน้าที่ทดแทนหน้าที่ของ Nce103 ในยีสต์สายพันธุ์ AS01 (Δnce103) ได้ ซึ่งสายพันธุ์ยีสต์ที่ถูกสร้างขึ้นใหม่นี้อาจถูกใช้เพื่อค้นหายารักษาโรคต้อหินได้ต่อไป นอกจากนี้ยังสามารถทำเอนไซม์ hCAII ให้บริสุทธิ์ได้ง่าย เพื่อใช้ในการทดสอบการยับยั้งกิจกรรมของ hCAII ใน in vitro ได้